- Forschung in der Abteilung Medizinische Biotechnologie
- Forschungsgruppe Transposition and Genome Engineering
- Forschungsgruppe Nonvirale Gentransfer-Arzneimittel
- Forschungsgruppe Tissue Engineering, Somatische Zelltherapeutika
- Forschungsgruppe Nonvitale Gewebepräparate, xenogene Zelltherapeutika
- Forschungsgruppe Humane transponierbare Elemente
Forschung in der Abteilung Medizinische Biotechnologie
Forschung in der Abteilung Medizinische Biotechnologie
Forschungsteam
Prof. Dr. Zoltán Ivics (Abteilungs- und Forschungsgruppenleiter)
Dr. Egbert Flory
Dr. Jürgen Scherer
Privat-Dozent Dr. Matthias Renner
Prof. Dr. Ralf Tönjes
Prof. Dr. Gerald Schumann
Rasante Fortschritte bei innovativen biomedizinischen Arzneimitteln führen zu wissenschaftlichen und regulatorischen Herausforderungen. Die Abteilung Medizinische Biotechnologie erarbeitet Lösungen für die Entwicklung und Zulassung dieser Arzneimittel für neuartige Therapien (ATMP), zu denen humane und xenogene somatische Zelltherapien, Gentherapie sowie Gewebezubereitungen gehören.
Forschungsschwerpunkt
Die Forschung der Abteilung hat ein abgestimmtes Programm etabliert, um die biologischen und biotechnologischen Grundlagen der Entwicklung von ATMPs zu erforschen. Als Projektpartner des Deutschen Konsortiums für translationale Krebsforschung (DKTK), identifizieren wir regulatorische Herausforderungen personalisierter Therapien und ATMPs zur Krebstherapie und erarbeiten Lösungsansätze. Eine besondere Herausforderung für Entwickler und Regulatoren sind Nebenwirkungen, die den erfolgreichen Einsatz in der klinischen Praxis behindern können. Um die mit ATMPs verbundenen Risiken zu bewerten, entwickeln wir Testsysteme zur
- systematischen Bewertung der Deregulierung von Wirtsgenfunktionen durch Gentherapeutika;
- Bestimmung der (epi)genetischen Stabilität zellbasierter Produkte;
- Analyse der zellulären Signalwege, die die Sicherheit von regenerativen Arzneimitteln beeinflussen.
Die zufällige genomische Integration therapeutischer Genvektoren kann zu schwerwiegenden Nebenwirkungen bei der Gentherapie führen. Um Abhilfe zu schaffen, entwickeln wir experimentelle Therapieansätze für den gezielten Gentransfer auf der Basis von nicht-viralen, transposonbasierten Vektorsystemen. Darüber hinaus untersuchen wir das Potenzial von Designer-Nukleasen wie CRISPR/Cas, die ortsspezifisches Genome Engineering sowie die Reparatur defekter Gene ermöglichen. Wir evaluieren diese Ansätze anhand von therapeutisch relevanten Zelltypen und für die jeweilige Krankheit geeigneten Tiermodellen, um die erfolgreiche klinische Umsetzung der Gentherapieforschung zu fördern und zu beschleunigen (AG Ivics).
Wechselwirkungen zwischen genomischen Parasiten wie Viren, transponierbaren Elementen (TEs, springende Gene) und Transgenvektoren mit Wirtszellen (einschließlich ihrer Integration in das Wirtszellgenom) können negative Folgen für das zelluläre Gleichgewicht (Homöostase) und damit für die Qualität und Sicherheit von Gentherapeutika und zellbasierten Produkten haben. Um die Sicherheit und Wirksamkeit von ATMPs zu verbessern, untersuchen wir die Wechselwirkungen zwischen humanen endogenen TEs und deren Wirtszellen, die Konsequenzen der Mobilisierung endogener TEs für genomische Destabilisierung, Expression von Wirtsgenen und biologische Sicherheit der therapeutisch relevanten pluripotenten Stammzellen sowie für die Entstehung von Krankheiten (AG Schumann). Weiterhin erforschen wir (epi)genetische Pfade, die zur Mobilisierung endogener TEs und von Chromatinmerkmalen beitragen, welche die Muster der genomischen Integration dieser TEs (AG Schumann) sowie von exogen verabreichten Genvektoren (AG Ivics) bestimmen.
Die Xenotransplantation von tierischen Zellen, Geweben oder Organen auf den Menschen ist eine mögliche Strategie, dem kritischen Mangel von menschlichen (allogenen) Spendern zu begegnen. Die Forschungsgruppe konzentriert sich auf Pathomechanismen endogener Retroviren von Tieren und einer Übertragung auf den Menschen und leistet damit einen wichtigen Beitrag zur Risikobewertung (AG Tönjes).
Forschungsgruppenleitung
Prof. Dr. Zoltán Ivics
Publikationen
Telefon: +49 6103 77 6000
E-Mail: Zoltan.Ivics@pei.de
Aktualisiert: 19.01.2021
Forschungsgruppe Transposition and Genome Engineering
Forschungsgruppe Transposition and Genome Engineering
Forschungsteam
Prof. Dr. Zoltán Ivics (Abteilungsleiter Medizinische Biotechnologie)
Dr. Csaba Miskey (Wissenschaftler)
Dr. Lacramioara Botezatu (Wissenschaftlerin)
Dr. Attila Sebe (Wissenschaftler)
Adrian Kovac (PhD-Student)
Maximilian Amberger (PhD-Student)
Matthias Ochmann(PhD-Student)
Tanja Diem (Technische Assistentin)
Janna Lustig (Technische Assistentin)
Tanja Leyendecker (Technische Assistentin)
Regina Gutberlet (Sekretärin)
Forschungsschwerpunkt
Transposons ("springende Gene") sind diskrete DNA-Abschnitte, die sich innerhalb der Genome über den Baum des Lebens hinweg bewegen und replizieren können. Transposons bieten ein neues Modell zur Untersuchung der DNA-Rekombination in höheren Organismen sowie der Wechselwirkung zwischen Wirt und Parasit. Transposons sind auch natürliche Transportvehikel für Gene, die als genetische Werkzeuge entwickelt werden.
Wir haben ein aktives Transposon aus DNA-Sequenzfossilien rekonstruiert, die im Fischgenom gefunden wurden. Dornröschen ist nicht nur das erste DNA-basierte Transposon, das in Zellen von Wirbeltieren aktiv ist, sondern auch das erste funktionelle Gen, das jemals aus inaktivem, uraltem genetischem Material rekonstruiert wurde, für das eine aktive, natürlich vorkommende Kopie entweder nicht existiert oder nicht existiert noch nicht isoliert. Technologien, die auf dem Gentransfer von Dornröschen basieren, haben die genomischen Manipulationen bei Wirbeltierarten revolutioniert.
Unser Labor verfolgt die Strategie, den Transpositionsmechanismus und seine Regulation zu verstehen und dieses Wissen zu übersetzen, um transposonbasierte genetische Werkzeuge für die Genomanipulation oder für die Gentherapie abzuleiten. Wir konzentrieren uns derzeit auf die vier Forschungsbereiche.
Forschungsgruppenleitung
Prof. Dr. Zoltán Ivics (Abteilungsleiter Medizinische Biotechnologie)
Publikationen
E-Mail: Zoltan.Ivics@pei.de
Aktualisiert: 24.01.2020
Forschungsgruppe Nonvirale Gentransfer-Arzneimittel
Forschungsgruppe Nonvirale Gentransfer-Arzneimittel
Forschungsteam
Privat-Dozent Dr. Matthias Renner (Forschungsgruppenleiter)
Dr. Julia Kaiser
Sunitha Joseph Myladoor
Tanja Kearns
Sylvia Panitz
Forschungsgruppenleitung
Privat-Dozent Dr. Matthias Renner
Publikationen
E-Mail: Matthias.Renner@pei.de
Aktualisiert: 21.11.2019
Forschungsgruppe Tissue Engineering, Somatische Zelltherapeutika
Forschungsgruppe Tissue Engineering, Somatische Zelltherapeutika
Forschungsteam
Dr. Egbert Flory (Forschungsgruppenleiter)
Dr. Ralf Sanzenbacher
Prof. Dr. Gerald Schumann
Forschungsgruppenleitung
Dr. Egbert Flory
Publikationen
E-Mail: Egbert.Flory@pei.de
Aktualisiert: 21.11.2019
Forschungsgruppe Nonvitale Gewebepräparate, xenogene Zelltherapeutika
Forschungsgruppe Nonvitale Gewebepräparate, xenogene Zelltherapeutika
Forschungsgruppe
Prof. Dr. Ralf R. Tönjes (Forschungsgruppenleiter)
Nicole Fischer (Biotechnologin)
Dr. Antonia W. Godehardt (Wissenschaftlerin/Postdoc)
Barbara Gulich (Technische Assistentin)
Forschungsschwerpunkt
Xenotransplantation - Infektionsrisiko durch endogene Schweine-Retroviren (PERV) und Schweine-Mikroorganismen
Endogene Retroviren (ERV) bilden ganzzahlige Genomkompartimente aller Organismen. ERV werden vertikal von Generation zu Generation vererbt. Endogene Retro-Proviren stellen zelluläre Gene dar, die zu irgendeinem Zeitpunkt während der Evolution, höchstwahrscheinlich durch Infektion, stabil auf die Keimbahn ihrer Wirte (z. B. Menschen, Schweine oder Schafe) übertragen wurden.
Wir arbeiten an der Charakterisierung biologischer Funktionen und mutmaßlicher pathologischer Eigenschaften von Mitgliedern der ERV-Familie. Das menschliche Genom besteht zu ca. 8% aus ERV-Sequenzen, das Genom von Schweinen enthält ebenfalls porcine endogene Retroviren (PERV). Der gegenwärtige Schwerpunkt liegt auf der Analyse der biologischen Eigenschaften dieser Proviren in voller Länge, die keine offensichtlichen genetischen Defekte aufweisen.
Für die xenogene Zelltherapie und Xenotransplantation wird derzeit angenommen, dass das Risiko der Übertragung fremder Mikroorganismen auf den Menschen die Haupthürde abgesehen von immunologischen und physiologischen Inkompatibilitäten darstellt. Die Verwendung von genetisch veränderten (transgenen und knock-out) Schweinen als Organspender für menschliche Empfänger vermittelt die Übertragung und Anpassung von replikationskompetentem gamma-Typ-PERV an Menschen. Wir haben zunächst funktionelle PERV von großen weißen Schweinen (deutsche Landrasse) auf molekularer und Genom-Ebene charakterisiert.
PERV infizieren humane embryonale Nierenzellen (Linie 293), [Czauderna et al., 2000]
Quelle: PEI
Es werden Assays und Reagenzien entwickelt, die für den verbesserten Nachweis und die Charakterisierung integrierter PERV-Sequenzen einschließlich Übertragung und Infektionen geeignet sind. Zwei humane Zelllinien unterstützen die PERV-Replikation, was Anlass zur Sorge gibt. Glücklicherweise konnte in unseren Händen keine produktive chronische Infektion von mit PERV inkubierten kultivierten menschlichen Lymphozyten beobachtet werden.
Zusätzlich wurde für die Genom- und Transkriptomanalyse von ganzen Schweinen ein maßgeschneiderter 8-Plex-60-k-Agilent-Microarray bestehend aus 26.967 Schweine-Targets sowie diagnostischen Sequenzen für PERV und mehrere humane (Trans-) Gene erstellt.
Insgesamt bewerten wir das mikrobielle Infektionsrisiko im Rahmen des Screenings von Schweinen, die für die Xenotransplantation von Zellen, Geweben und Organen konzipiert sind. Insbesondere multitransgene Schweine werden durch Microarray-, RNA-Seq- und / oder Multiplex-PCR sowie durch speziell entwickelte Assays auf alle bekannten Mikroorganismen sowie unbekannte Agenzien untersucht.
Forschungsgruppenleitung
Prof. Dr. Ralf R. Tönjes
Publikationen
E-Mail: Ralf.Toenjes@pei.de
Aktualisiert: 21.11.2019
Forschungsgruppe Humane transponierbare Elemente
Forschungsgruppe Humane transponierbare Elemente
Forschungsteam
Prof. Dr. Gerald G. Schumann (Forschungsgruppenleiter)
Dr Caroline Küstermann (Postdoc)
Alexander Fröhlich (B.Sc.)
Alejandro Barbero (Bachelor Student)
Theresa Füller (Bachelor Student)
Ulrike Held (Technische Assistentin)
Forschungsschwerpunkt
Die Forschung der Arbeitsgruppe beruht auf dem Interesse an Wechselwirkungen zwischen humanen LINE-1 (Long Interspersed Nuclear Element-1, L1)-retrotransposons, welche die funktionelle und aktive Gruppe autonomer Nicht-LTR-Retrotransposons im menschlichen Genom darstellen, und deren Wirt. Wir untersuchen die Konsequenzen der L1-vermittelten Retrotransposition für genomische Destabilisierung, Expression von Wirtsgenen und Krankheiten, die mit der L1-Aktivität in humanen pluripotenten Stammzellen im Zusammenhang stehen.
Obwohl das menschliche Genom ca. 106 L1-Kopien enthält, die ca. 17% der genomischen DNA abdecken, ist nur eine Untergruppe von 80-100 L1-Elementen funktionell und retrotranspositionskompetent. L1-Elemente replizieren über ein RNA-Intermediat mithilfe eines Copy-and-Paste-Mechanismus. Die L1-kodierte Proteinmaschinerie ist verantwortlich für die Mobilisierung von L1-Elementen in cis, aber auch für die Transmobilisierung von nicht-autonomen humanen Non-LTR-Retrotransposons wie SINEs (z. B. Alu) und SVA-Elementen (Abbildung 1).
Auch jede Art von zellulären mRNA-Molekülen können durch L1-kodierte Proteine mobilisiert werden, was zur Entstehung prozessierter Pseudogene führt. Die Generierung von ca.34% des gegenwärtigen menschlichen Genoms ist eine Folge der Aktivität von L1-Elementen. Humane L1-Elemente werden in der Keimbahn, während der Embryonalentwicklung, der Entstehung des zentralen Nervensystems sowie später während der adulten Neurogenese aktiviert und mobilisiert.Insertionen in kodierende Regionen finden statt und können die Enstehung von Krankheiten verursache. Eine gesteigerte Retrotranspositionsrate ist in Tumorzellen zu beobachten und korreliert mit Alterungsvorgang, Stress, DNA-Schädigung sowie der Verkürzung von Telomeren. L1-vermittelte Retrotransposition findet in zahlreichen kultivierten, transformierten, somatischen Zelllinien sowie in humanen pluripotenten Stammzellen wie embryonalen (hESCs) und induzierten pluripotenten (hiPSCs) Stammzellen statt (Abbildung 2).
Immunofluoreszenzfärbung von hiPS-Zellkolonien zum Nachweis der L1 ORF1p-Expression in von HFF1-Zellen abgeleiteten pluripotenten Stammzelllinien hFF-iPS4 und hiPS-SB5
Da hESCs und hiPSCs die theoretisch unbegrenzte Kapazität zum ‚Self-Renewal‘ besitzen, und in jedem beliebigen somatischen Zelltyp doifferenziert werden können, werden beide Stammzelltypen für die Etrablierung von Modellen der Krankheitsentstehung und für das Studium von Entwicklungsvorgängen verwendet, und sind vielversprechende im Hinblick auf substitutive und regenerative Therapieansätze. Allerdings besteht die Gefahr, daß genetische und/oder epigenetische Aberrationen, die L1-vermittelte Retrotranspositionsereignisse einschließen, und sich während des Reprogrammierungsvorgangs und der in-vitro Expansion in hiPSCs sowie während der Kultivierung von hESCs stattfinden, deren Anwendung in der regenrativen Medizin erschweren, denn sie könnten deren Identität und/oder ihre Fähigkeit zu differenziern beeinträchtigen und so das Risiko der Tumorentstehung nach Implantation der von hPSCs abgeleiteten differenzierten Zellen steigern.
Wir untsersuchen die Auswirkungen der endogenen L1-Aktivität auf genomische und epignetische Integrität von hPSCs und bewerten, ob die Aktivierung von L1-expression und Mobilisierung negative Auswirkungen hat auf eine potenzielle Anwendung von hPSCs in der Zelltherapie durch eine Erhöhung des tumorigenen Risikos, durch eine Einschränkung des Differenzierungspotenzials oder durch die Verursachung von potenziellen funktionellen Defiziten der differenzierten Derivate.
Endogene L1-Aktivität verursacht lokale genomische Instabilität sowie genomisches Rearrangement
Abgesehen von ihrem Einfluss auf die Genomevolution auf Speziesebene verändert die L1-vermittelte Retrotransposition die einzelnen Genome auf viele verschiedene Arten. Dieser Prozess ist häufig mit der Induktion lokaler genomischer Instabilitäten verbunden. L1-Insertionen in genische funktionelle Sequenzen können in voller Länge oder 5'-verkürzt sein oder Inversionen enthalten und die Genexpression verändern (z. B. durch Insertionsmutagenese). Bisher wurde gezeigt, dass 120 Fälle verschiedener genetischer (z. B. Hämophilie, Mukoviszidose, Neurofibromatose usw.) und tumorigener Erkrankungen (z. B. Brustkrebs, Dickdarmkrebs usw.) die Folge solcher lokaler genomischer Instabilitäten sind, die durch L1-, Alu- oder SVA-Neuinsertionen verursacht wurden. Etwa 20% aller L1-Insertionen sind mit strukturellen Rearrangements verbunden, die Deletionen bzw. Insertionen im Bereich von 1 bp bis mehr als 130 kb einschließen.
Bisher wurde gezeigt, dass L1- und Alu-vermittelte nicht-allelische homologe Rekombinationsereignisse (NAHR) die Ursache für mindestens 73 nachgewiesene Fälle von genetischen und tumorigenen Erkrankungen sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Endonukleaseaktivität von ORF2p mit der Induktion von Doppelstrangbrüchen in Säugetierzelllinien zusammenhängt, die verschiedene Zellreaktionen wie Apoptose, Zellalterung, Zellzyklus-Checkpoints und DNA-Reparaturreaktionen induzieren.
Einfluss der Aktivität von L1-, Alu- und SVA-Elementen auf die Genexpression
L1-vermittelte Retrotransposition von L1, Alu und SVA-Elementen kann die Expression von Genen durch verschiedene Mechanismen beeinflussen:1) Intronische L1-Sequenzen beeinträchtigen die Transkription des Wirtsgens indem sie RNA-Polymerase II beim Durchlesen der L1-Sequenzen ‚abbremsen‘; 2) Das Retrotransposon kann neue Spleißstellen bereitstellen, die die Exonisierung oder alternatives Spleißen fördern können, und 3) sie tragen häufig zusätzliche Polyadenylierungssignale, die eine Transkriptionstermination induzieren.4) Sense- und Antisense-Promotor von L1-Elementen werden häufig verwendet, um die Sense- oder Antisense-Transkription umgebender Wirtsgene zu initiieren.
Abbildung 1: L1-Retrotranspositionszyklus. Ein funktionelles L1-Element wird transkribiert und die L1-mRNA (rot) wird in das Zytoplasma exportiert, translatiert und L1-kodierte Proteine (L1 ORF1p, L1 ORF2p) binden an ihre eigene mRNA (cis-Präferenz), oder gelegentlich an Alu oder SVA RNAs, und bilden Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexe, die in den Zellkern reimportiert werden. Anschließend wird die L1-RNA (bzw. Alu oder SVA RNA) revers transkribiert und die cDNA durch einen Mechanismus, der als Target-Primed Reverse Transcription (TPRT) bezeichnet wird, in das Genom insertiert. Häufig schreitet die reverse Transkription nicht bis zum 5'-Ende fort, was zu verkürzten nicht funktionellen L1-de-novo-Insertionen führt.
Abbildung 2: Immunofluoreszenzfärbung von hiPS-Zellkolonien zum Nachweis der L1 ORF1p-Expression in von HFF1-Zellen abgeleiteten pluripotenten Stammzelllinien hFF-iPS4 und hiPS-SB5. a) Die Anfärbung von ORF1p (rot) zeigt die Aktivierung der endogenen L1-Expression als Folge der Reprogrammierung von HFF1-Zellen in die beiden pluripotenten Stammzelllinien. Die Zellenwurden anch Passage (p) 16 bzw. 60 angefärbt. Die Oct3/4-Anfärbung (grün) bestätigt den pluripotenten Status der analysierten Stammzellkolonien. b) Vergrößerung des Bereichs des gestrichelten Rechtecks innerhalb der ‚merged’- Abbildung von hiPS-SB5 in a). Die Anfärbung der Zellkolonie zeigt die Lokalisierung endogener L1-ORF1-Proteine in cytoplamatischen Foci. Maßstabsleiste, 20 μm.
Forschungsgruppenleitung
Prof. Dr. Gerald G. Schumann
Publikationen
E-Mail: Gerald.Schumann@pei.de
Aktualisiert: 21.11.2019